Basisprotocol voor Laboratorium Diagnostiek van Hemoglobinopathie Dragerschap

Giordano P.C.
Hemoglobinopathieën Laboratorium,
Klinische Genetica/LDGA,
Leids Universitair Medisch Centrum

Zie ook

European Molecular Genetics Quality Network 
Voor specialistische laboratoria op het gebied van Hb-pathie diagnostiek zijn door de EMQN Europese kwaliteitsnormen afgesproken. Deze normen, de beknopte samenvatting van de laboratoriumtechnieken en aanbevelingen voor de diagnostiek van dragers kunt u vinden in de volgende publicatie:  

EMQN Best Practice Guidelines for molecular and haematology methods for carrier identification and prenatal diagnosis of the haemoglobinopathies 

This article has been amended since online publication. A corrigendum also appears in this issue. 

Joanne Traeger-Synodinos*,1, Cornelis L Harteveld2, John M Old3, Mary Petrou4, Renzo Galanello5, Piero Giordano2, Michael Angastioniotis6, Barbara De la Salle7, Shirley Henderson3 and Alison May8 on behalf of contributors to the EMQN haemoglobinopathies best practice meeting 

Haemoglobinopathies constitute the commonest recessive monogenic disorders worldwide, and the treatment of affected individuals presents a substantial global disease burden. Carrier identification and prenatal diagnosis represent valuable procedures that identify couples at risk for having affected children, so that they can be offered options to have healthy offspring. Molecular diagnosis facilitates prenatal diagnosis and definitive diagnosis of carriers and patients (especially ‘atypical’ cases who often have complex genotype interactions). However, the haemoglobin disorders are unique among all genetic diseases in that identification of carriers is preferable by haematological (biochemical) tests rather than DNA analysis. These Best Practice guidelines offer an overview of recommended strategies and methods for carrier identification and prenatal diagnosis of haemoglobinopathies, and emphasize the importance of appropriately applying and interpreting haematological tests in supporting the optimum application and evaluation of globin gene DNA analysis. 

European Journal of Human Genetics (2015) 23, 426–437; doi:10.1038/ejhg.2014.131; published online 23 July 2014

Download hier het gehele artikel.

Introductie

Dragerschap voor de meest voorkomende en tevens pathologisch meest relevante HbP vormen (HbS, HbE, HbC, HbD, α- en β-thalassemie) wordt met hoge frequenties geconstateerd in Mediterrane, Afrikaanse en Aziatische populaties.

Preventie protocol

Preventiestrategieën zijn in diverse landen toegepast. De meest succesvolle zijn gebaseerd op informatie aan jonge aanstaande ouders en op het aanbieden van dragerschaps-diagnostiek op individuele basis. Dit preventieprotocol begint meestal in de HA- of specialistenpraktijk en wordt gefaseerd aangeboden. Na informatie verstrekking wordt in eerste instantie één van de twee partners onderzocht, bij voorkeur de vrouw. Bij een negatieve uitslag is het paar niet “at risk” en hoeft de partner niet te worden onderzocht. Bij een positieve uitslag dient de partner te worden onderzocht.
Bij een negatieve uitslag van de partner is het paar nog steeds niet “at risk“.
Bij positieve uitslag van de partner is het paar wel “at risk” en dient voor nadere genetische informatie en advies naar één van de Klinische Genetische Centra te worden verwezen (zie strategie schema).



Dragerschapsanalyse

Hoe worden potentiële dragers door de arts of klinisch chemicus herkend?
Dragers van α- en β-thalassemie en van HbE kunt u herkennen aan hun microcytair bloedbeeld (FlowChart 1). Dragers van HbS, C en D vertonen doorgaans licht afwijkende of normale bloed parameters, meestal zonder anemie, waardoor slechts de etnische afkomst of de familie geschiedenis als indicatie kan dienen.

  • Eerste stap: Indicatie op grond van persisterende anemie, afwijkende bloed parameters of verdenking wegens anamnese of etnische achtergrond.
    Er wordt op een microcytair hypochroom bloedbeeld gelet, met of zonder anemie, bij normale ferritine waarde, of persisterend na ijzer suppletie, daarbij kan herkomst uit een hoog risicogebied een aanwijzing zijn. Er wordt tevens aandacht besteed aan patiënten zonder duidelijk afwijkende bloed parameters die een familie geschiedenis met HbP hebben of/en vanwege hun etnische achtergrond een verhoogde dragerschapskans zouden kunnen hebben voor de mutanten HbS, C of D (Caraibisch, Afrikaans, Mediterrane of Aziatische afkomst). Zie FlowChart 1:

  • Tweede stap: De Hb-pathie routine analyse.
    Bij een persisterend microcytair bloedbeeld, zonder ijzer gebrek, of bij één van de andere indicaties, wordt het laboratorium geraadpleegd voor een Hb-elektroforese of Hb-chromatografie (HPLC) met een quantitatieve bepaling van de HbA2 en HbF fracties. Hiermee worden de normale (HbA, HbA2 en HbF) en meest voorkomende abnormale Hb fracties (HbS, C, E, D, e.a.) geanalyseerd. Zie flowchart 2:


DNA analyse kunt u direct aanvragen door één buisje EDTA bloed met het ingevulde aanvraagformulier per snelpost te versturen.

Aantonen van HbS door middel van Sikkelceltest

Hemoglobine S (HbS) is een veelvoorkomend abnormaal hemoglobine en is met een eenvoudige test aan te tonen. HbS vormt lange polymeren in een zuurstofarme omgeving. Dit fenomeen veroorzaakt vervorming van de erythrocyten tot sikkelachtige abnormale cellen. Het is mogelijk dit fenomeen in vitro te reproduceren d.m.v. de sikkeltest:

Benodigdheden:

  1. bloedmonster (volbloed)
  2. Na-metabisulfiet, 1% oplossing in PBS(vers). Bij lage HbS percentages en/of HbF gebruik 2% oplossing. Los het zout op niet op een vortex maar door rustig te mengen.
  3. microscoopglaasjes, dekglaasjes
  4. solutie-lijm
  5. reageerbuis

Handelingen:

  • Meng in de reageerbuis 5 druppels Na-Metabisulfiet-oplossing met 1 druppel bloed.
  • Deponeer één druppel van het mengsel op het microscoopglaasje.
  • Dek de druppel met een dekglaasje af (zonder er luchtbellen onder te laten).
  • Veeg het overtollige vocht om het dekglaasje voorzichtig af.
  • Plak de rand van het dekglaasje af met solutie. Moet wel goed lucht dicht zijn.
  • Bekijk na 30 minuten onder de microscoop (100 maal vergroting met immersie-olie).
een plaatje van sikkelcellen.

Aantonen van a° thalassemie door middel van inclusion bodies test

Bij alfa° thalassemie allelen (–/aa) kunnen door zeldzame somatische (-a/) mutaties, sporadische erythrocyten ontstaan met hetzelfde overschot aan b globine als bij HbH ziekte (–/-a) het geval is.
Deze rode cellen (β4 inclusion bodies) zijn aantoonbaar op een uitstrijkje van EDTA bloed, na 30 minuten incubatie 1:1 met gefilterd 1% brilliant cresyl blue oplossing in PBS op 37° C. Twee uur incubatie op kamer temperatuur met dezelfde oplossing is ook mogelijk.

Inclusionbodies
Zeldzame rode cel met typische HbH (β4) insluitsels die, na vitale kleuring met BCB, waarneembaar zijn bij –/aa thalassemie genotypes

Hoe worden de uitslagen geïnterpreteerd?

  • Bij een abnormale Hb fractie op capillair electroforese (CE) of HPLC op positie S is een bevestiging via sikkelceltest nodig. Bij een positieve sikkeltest (zie figuur sikkeltest) in aanwezigheid van circa 60% HbA is (in een niet getransfundeerde patiënt!) sprake van een HbS drager (heterozygoot HbA/S) (zie electroforese en HPLC illustratie).
  • Bij een abnormale Hb fractie op electroforese of HPLC op positie S en een positieve sikkeltest zonder HbA is er sprake van een patiënt met sikkelcelziekte (homozygoot HbS/S, of HbS/β-thalassemie) (zie electroforese en HPLC illustratie).

Andere mutanten

  • Abnormale banden op positie C, D, E of op andere posities, al of niet in combinatie met HbS of HbA dienen in een gespecialiseerd laboratorium op DNA niveau nader te worden gekarakteriseerd.
  • Bij HbA2 percentages tussen 3,5 en 8% zal doorgaans sprake zijn van een heterozygoot β-thalassemie (de HbA2 waarde is niet van diagnostische betekenis bij baby’s), maar er zijn zeldzame β-thalassemie vormen bekend die gepaard gaan met een normale HbA2 waarde van 2,5-3,5%).
  • Bij een HbA2 percentage  2,5% zonder ijzerdepletie, zou er sprake kunnen zijn van een α-thalassemie (bevestiging dient in een gespecialiseerd DNA-laboratorium te worden gedaan).
  • HbF percentages boven de 1% zijn vanaf het 2de levensjaar abnormaal. Bij β-thalassemie heterozygoten is de HbF soms licht tot sterk verhoogd.

De technische aanpak en materiaal keuze

Verschillende methodieken zijn beschikbaar voor dragerschapsdiagnostiek van HbS, C, E, D, β- en α-thalassemie. Naast de manuele methodieken zoals Hb-electroforese en bepaling van het HbA2 percentage, bestaan tegenwoordig geautomatiseerde HPLC en CE methoden.

Hier volgen voorbeelden van dragerschapsdiagnostiek voor vaak voorkomende Hb-pathieën verricht met de HPLC ‘Variant I’ (Bio-Rad) met gebruik van de β-thalassemia short program kit, en op de Menarini HA 8160 opgesteld in HbA2 mode. Andere scheidingstechnieken zijn Capillair Electroforese (Sebia), en Premier High Resolution (Trinity Biotech), die momenteel in ons laboratorium worden gebruikt.





Conclusie

  • Informatie en dragerschapsdiagnostiek kunnen op eenvoudige wijze in Nederland worden aangeboden, zonder stigmatiserende screeningsmethoden, in de privacy van de huisarts en specialisten praktijk (Giordano & Harteveld 1998).
  • Dragerschapsdiagnostiek kan in de meeste centrale laboratoria met de geautomatiseerde HPLC of CE of met andere automatische of manuele methoden worden verricht.
  • Bij onvoldoende ervaring kan worden verwezen naar andere geroutineerde laboratoria. Bij complexe casussen, verdenking van risicoparen, en risicovaststelling, kan (kosteloos) naar het referentie lab (Het Hemoglobinopathieën Laboratorium te Leiden) worden verwezen.
  • De onderzoeksaanvrager dient op het belang van vervolgonderzoek t.b.v. preventie te worden gewezen als het laboratorium een positieve dragerschapsdiagnose heeft gesteld. Hiervoor volgen korte informatieteksten ten behoeve van de onderzoeksaanvrager, meestal de behandelend arts, die de het belang van vervolgonderzoek moet onderkennen.

Korte teksten ter informatie van de onderzoekaanvrager ter begeleiding van een positieve HbP dragerschapsuitslag voor de HbS, C, E, D, α- en β-thalassemie defecten


Bij Kind: Patiënt is drager bevonden van ….. . I.v.m. het mogelijk aanwezig genetische risico voor ernstige vormen van HbP is het geïndiceerd de beide ouders (en familie) te informeren en op HbP dragerschap te laten controleren.

Bij Jong-volwassen: Patiënt is drager bevonden van ….. . I.v.m. het mogelijk aanwezig genetische risico voor ernstige vormen van HbP in het nageslacht is het geïndiceerd de patiënt te informeren en de eventuele partner en familie op HbP dragerschap te laten controleren.

Bij ouderen: Patiënt is drager bevonden van ….. . I.v.m. het mogelijk aanwezig genetische risico voor ernstige vormen van HbP is het geïndiceerd patiënt en nageslacht van patiënt te informeren en op HbP dragerschap te laten controleren. Voor alle jonge HbP dragers is partneronderzoek geïndiceerd.

Folders en Informatie

Voor aanvullende informatie over laboratoriumdiagnostiek, preventie en voor informatiefolders t.b.v. uw patiënten in verschillende talen kijkt u hier.

Hemoglobinopathieën Laboratorium       tel.: 071-5269817

Afd. Klinische Genetica/LDGA (LUMC)
Einthovenweg 20
Postbus 9600, 2300 RC Leiden
Email: c.l.harteveld@lumc.nl